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Tecnologia

Análise da expressão genética

Os arrays GeneChip® da Affymetrix permitem a análise da expressão genética global em vários organismos modelo. Para cada gene representado no array existem múltiplos pares de sondas (e.g. 11 pares), escolhidos apartir do terminal 3´ da respectiva sequência do mRNA. Cada par consiste numa sonda perfect match (PM- a sua sequência é perfeitamente complementar à sequência alvo) e numa sonda mismatch (MM- a sua sequência é idêntica à PM com excepção para uma única base no centro do oligonucleótido que se encontra alterada), permitindo desta forma a quantificação e subtração dos sinais causados por hibridação cruzada. (Ilustração do princípio do método).

A amostra (moléculas alvo) que se pretende analizar no GeneChip® é preparada apartir de células ou tecidos, de onde é isolado RNA total (ilustração gráfica). Num primeiro passo, é obtido cDNA em cadeia dupla contendo a sequência do promotor T7 no seu terminal 5´. Esta região é depois usada para transcrição in vitro, na qual nucleótidos marcados com biotina (biotina-ddUTP e biotina-ddCTP) são incorporados, obtendo-se então cRNA. Este segundo passo permite um aumento de aproximadamente 100x do material inicial possibilitando, no caso do procedimento standard, partir de 5 µg de RNA total. No novo procedimento em pequena escala os nucleótidos marcados com biotina não são incorporados no cRNA no passo anteriormente descrito. Em vez disso, o cRNA não marcado é usado para uma nova amplificação de cDNA, seguida de transcrição in vitro com os nucleótidos marcados com biotina. Neste novo procedimento, a quantidade de material inicial necessário é cerca de 50 ng de RNA total, facilitando os estudos onde este material é o factor limitante, como no caso da técnica de microdissecação por captura laser, pequenas biopsias e células separadas por citometria de fluxo. Em ambos os procedimentos, o cRNA marcado é fragmentado (resultando daí moléculas com um tamanho entre 35-200 bases) e hibridado ao GeneChip® durante 16 horas. Contrariamente aos arrays de cDNA, as duas amostras que se pretendem comparar não são hibridadas no mesmo array, mas sim em GeneChip® arrays separadamente. Os fragmentos de cRNA marcados com biotina são por sua vez marcados com um conjugado de estreptavidina fluorescente e a intensidade da fluorescência para cada sonda é medida com um scanner apropriado.

No primeiro passo de análise, os arrays são normalizados para reduzir variações de origem não-biológica. Depois, usando métodos estatísticos aplicados às intensidades de fluorescência de todos os pares de sondas para cada gene no array, é calculado um valor que traduz a abundância relativa de cada transcrito. Adicionalmente, é calculado o grau de confiança com que um determinado transcrito é detectado (presente) ou não (ausente). Nas análises comparativas subsequentes, compara-se o valor de expressão obtido para cada gene nas duas amostras, permitindo assim identificar genes cuja expressão aumentou (ou diminuiu) e quantificar essas alterações.



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