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Tecnologia

Genotipagem em larga escala

O GeneChip® Human Mapping 10K Array da Affymetrix é uma ferramenta baseada na hibridação entre alelos específicos que têm por finalidade a genotipagem de polimorfismos num único nucleótido (SNP). Este array contém sondas correspondentes aos dois possíveis alelos para cada SNP. Após hibridação do DNA alvo ao array, determina-se se um SNP é AA, AB ou BB analisando o sinal resultante da hibridação entre o alelo e a sonda específica.

Cada SNP é representado por quarenta oligonucleótidos (25-mer) diferentes, tendo cada oligonucleótido uma ligeira variação nas sequências perfect matches e mismatches e nas regiões que flanqueiam o SNP. (Ilustração do princípio)

Este ensaio requer 250 ng de DNA que é digerido com a enzima de restrição XbaI e da qual resultam fragmentos de vários tamanhos. (Ilustração do princípio). Moléculas adaptadoras ligam-se a todos os fragmentos, mas através de amplificação por PCR (usando iniciadores que reconhecem a sequência dos adaptadores) são preferencialmente amplificados fragmentos com um tamanho que varia entre 250 e 1000 pb. Os fragmentos de DNA amplificados são fragmentados, marcados nas extremidades e hibridados ao GeneChip® Mapping 10K Array. Após leitura da intensidade de fluorescência com um scaner é determinado cada genótipo individual com base no software GDAS 2.0 da Affymetrix. Com 11 555 SNP´s presentes no array e um grau de detecção superior a 90%, é possível obter mais de 10 000 genótipos por amostra.



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